懸(xuan)浮(fu)(fu)細(xi)胞總是在孵抗體(ti)和洗的時(shi)候被(bei)沖掉，懸(xuan)浮(fu)(fu)細(xi)胞做免疫熒光(guang)怎(zen)么(me)固定？

傳統方法

實驗步驟：

1. 細(xi)胞在冰浴中冷卻，然后用臺式離心機于4℃以800 g 離心5 min，吸去培養液并以4℃PBS重懸細(xi)胞。

2. 離心吸去(qu)PBS，以1~2 ml 2%PFA固(gu)(gu)(gu)定(ding)液，或(huo)2%PFA固(gu)(gu)(gu)定(ding)液/0.1% Triton X-100重懸細胞，置冰上固(gu)(gu)(gu)定(ding)30 min。

3. 離(li)心、吸去固定液，用15 ml 4℃ PBS重懸細(xi)胞(bao)，放(fang)5 min 后(hou)，用PBS再次洗滌細(xi)胞(bao)。

4. 稀釋的第一抗(kang)體(ti)于4℃用(yong)微量離心機以(yi)13 500 g 離心2 min，250 μl 抗(kang)體(ti)足夠用(yong)于5x106細(xi)胞。

5. 離心(xin)細(xi)胞(bao)，吸去PBS，重(zhong)懸細(xi)胞(bao)于第一抗體(ti)中，置(zhi)4℃溫育1 h。

6. 用4℃ PBS稀釋細(xi)胞和(he)抗體(ti)至15 ml。

7. 離(li)心，吸去PBS，以(yi)4℃ PBS重懸細(xi)胞(bao)，重復(fu)1次。

8. 第二(er)抗體4℃用微量離(li)心機以13 500 g 離(li)心2 min，5x106細胞用250 ul 抗體足(zu)夠。

9. 吸去(qu)PBS，以第二抗體重懸細(xi)胞(bao)，4℃溫(wen)育1 h，重復步驟6及步驟7。

10. 除非立即觀察細胞，否則在(zai)進行細胞濃(nong)縮的下一步操作(zuo)之前應以(yi)鋁萡包裹(guo)離心(xin)管并冷藏。

11. 離心(xin)細胞(bao)并以(yi)少量PBS重懸(xuan)（勿(wu)用水），將細胞(bao)懸(xuan)液滴于多(duo)聚-L-賴氨酸覆層的載玻片上，加上蓋玻片，盡可能馬上觀察結果。 

鏡下觀察：沒有細胞，原來(lai)掉片了！！！

靶點科技Shi-Fix懸浮細胞固定免疫熒光專用玻片，帶來痛點解決方案。像貼壁細胞一樣處理懸浮細胞，好簡單啊，就四步！