emfret成立于(yu)2002年,emfret公司專注心血管和血液系統研究用抗體研發和生產,emfret公(gong)司的(de)抗體不僅適用于
流式分析、WB檢測,還可用(yong)于免疫(yi)組化/免疫熒(ying)光及免疫共(gong)沉淀檢測。
產(chan)品列表
貨號 | 產品名稱 | 規格 |
M011-0 | mouse GPVI | 0.1mg |
M011-1 | mouse GPVI | 1.5mL |
M025-0 | Integrin alphaIIbbeta3 (GPIIb/IIIa, CD41/CD61) | 0.5mg |
M025-1 | Integrin alphaIIbbeta3 (GPIIb/IIIa, CD41/CD61) | 1.5mL |
M025-2 | Integrin alphaIIbbeta3 (GPIIb/IIIa, CD41/CD61) | 1.5mL |
M025-3 | Integrin alphaIIbbeta3 (GPIIb/IIIa, CD41/CD61) | 1.5mL |
M021-0 | Integrin alphaIIbbeta3 (GPIIb/IIIa, CD41/CD61) | 0.5mg |
M021-1 | Integrin alphaIIbbeta3 (GPIIb/IIIa, CD41/CD61) | 1.5mL |
M022-0 | Integrin alphaIIbbeta3 (GPIIb/IIIa, CD41/CD61) | 0.5mg |
M023-2 | Integrin alphaIIbbeta3 (GPIIb/IIIa, CD41/CD61) | 1.5mL |
M024-0 | Integrin alphaIIb (GPIIb, CD41) | 6mg |
M030-0 | Integrin beta3 chain (GPIIIa, CD61) | 0.5mg |
M031-0 | Integrin beta3 chain (GPIIIa, CD61) | 0.5mg |
M031-1 | Integrin beta3 chain (GPIIIa, CD61) | 1.5mL |
M040-0 | GPIbalpha (CD42b) | 0.5mg |
M040-1 | GPIbalpha (CD42b) | 1.5mL |
M040-2 | GPIbalpha (CD42b) | 1.5mL |
M040-3 | GPIbalpha (CD42b) | 1.5mL |
M041-0 | GPIbalpha (CD42b) | 0.5mg |
M041-1 | GPIbalpha (CD42b) | 1.5mL |
M042-0 | GPIbalpha (CD42b) | 0.5mg |
M042-1 | GPIbalpha (CD42b) | 1.5mL |
M043-0 | GPIbalpha (CD42b) | 0.5mg |
M043-1 | GPIbalpha (CD42b) | 1.5mL |
M050-0 | GPIbbeta (CD42c)mouse and human | 0.5mg |
M050-1 | GPIbbeta (CD42c)mouse and human | 1.5mL |
M051-0 | GPIX (CD42a) | 0.5mg |
M051-1 | GPIX (CD42a) | 1.5mL |
M060-1 | GPV (CD42d) | 1.5mL |
M061-0 | GPV (CD42d) | 0.5mg |
M061-1 | GPV (CD42d) | 1.5mL |
M070-0 | Integrin alpha2 chain (CD49b, GPIa) | 0.5mg |
M070-1 | Integrin alpha2 chain (CD49b, GPIa) | 1.5mL |
M071-0 | Integrin alpha2 chain (CD49b, GPIa) | 0.5mg |
M071-1 | Integrin alpha2 chain (CD49b, GPIa) | 1.5mL |
M080-0 | Integrin alpha5 chain (CD49e)mouse and human | 0.5mg |
M080-1 | Integrin alpha5 chain (CD49e)mouse and human | 1.5mL |
M110-0 | CD9 | 0.5mg |
M110-1 | CD9 | 1.5mL |
M120-0 | CD31 (PECAM-1) | 0.5mg |
M130-0 | CD62P (P-selectin) | 0.5mg |
M130-1 | CD62P (P-selectin) | 1.5mL |
M130-2 | CD62P (P-selectin)(靶點科(ke)技現貨) | 1.5mL |
P150-1 | von Willebrand Factor (vWF) | 1.5mL |
P140-1 | fibrinogen | 1.5mL |
P180-1 | negative control | 1.0mL |
P190-1 | negative control | 1.0mL |
P190-2 | negative control | 1.0mL |
P190-3 | negative control | 1.0mL |
R300 | Antibodies for Mouse Platelet Depletion(靶(ba)點(dian)科(ke)技常年現貨) | 0.5mg |
C301 | Antibodies for Mouse Platelet Depletion | 0.5mg |
D200 | Two-Color Analysis of Mouse Platelet Activation(靶(ba)點科技(ji)現貨) | 2.0ml |
X488 | In Vivo Mouse Platelet Labeling | 0.1mg |
X649 | In Vivo Mouse Platelet Labeling | 0.1mg |
抗體相(xiang)關實驗技術Protocols
一(yi)、小鼠血小板表面糖蛋(dan)白(bai)的(de)流式細胞術分析(xi)
緩沖液和試劑準備:
Tris緩(huan)沖鹽水/肝素(TBS/Hep):20mM Tris/HCl;137mM NaCl;pH 7.3;含有20U/ml肝(gan)素。
磷酸鹽緩沖液(PBS):137mM NaCl;2.7mM KCl;1.5mM KH2PO4;8mM Na2HPO4;pH 7.14。
改良臺氏液(ye)/改良Tyrode''s溶液:134mM NaCl;0.34mM Na2HPO4;2.9mM KCl;12mM NaHCO3;20mM Hepes;pH 7.0;5mM葡萄糖;0.35%(w/v)牛血清白(bai)蛋白(bai)。
腺苷三磷(lin)酸雙磷(lin)酶Apyrase:溶于水(10 U/mL),在-20°C下儲存(cun)。
前列環素(su)Prostaglandin(Prostaglandin 2, PGI2):溶(rong)于水(shui)(1 mM),在-20°C下儲存。
CaCl2:1 M溶于水。
稀(xi)釋或洗(xi)滌全血的制備:
1、用肝素化玻璃毛細管(如環帽)從眶后神經叢抽(chou)取50µL血液,放(fang)入1.5 ml含有200µLTris緩(huan)沖鹽水/肝素(20 U/ml)的試(shi)管中。
2、在1 mL Tyrode緩沖液中稀釋,用于流(liu)式細胞儀分析(xi)。
3、為了制備洗滌過的血液(ye),將稀(xi)釋的血液(ye)以(yi)900 x g離心5分鐘(zhong),去除(chu)上清液,并將沉(chen)淀重懸(xuan)在1.25 mL Tyrode緩沖液中。
4、在實驗開始前直接加入1mM CaCl2。
注:對(dui)于凝(ning)血酶誘導的血小板活(huo)化,必須(xu)去(qu)除血漿以防止抗(kang)凝(ning)血酶活(huo)性。
血(xue)小板制備(bei):
1、制備(bei)洗滌過的(de)血(xue)小(xiao)(xiao)板是一(yi)種更耗(hao)時的(de)方法,需要大量的(de)血(xue)液,但產(chan)生的(de)血(xue)小(xiao)(xiao)板制劑可以使用數小(xiao)(xiao)時。
2、用1.5 cm玻璃毛細管從眶(kuang)后叢收(shou)集(ji)0.5-1 mL血液,放入含有200 µL TBS/肝素(20 U/ml)的1.5 mL管中(zhong)。去除含有一些紅細胞(bao)的(de)上清(qing)。
3、以500 x g離(li)心樣品5分鐘(zhong),并將富含血小板的血漿(PRP)轉(zhuan)移到新的試管(guan)中。
4、將血小(xiao)板懸浮液以300 x g離心8分鐘,并將不含任何紅(hong)細胞的PRP轉移到(dao)新的(de)試管中。
5、加入0.5 µM前(qian)列環素(su)(PGI2),以1300 x g離心5分鐘(zhong)。
6、將(jiang)血小(xiao)板顆粒重新懸浮在1 mL Tyrode緩沖液中,加入0.02 U/mL腺苷三磷(lin)酸雙磷(lin)酶和0.5 µM前列環素(su),在37℃下孵(fu)育5分鐘,并在1300 x g下離心(xin)5分鐘(zhong)。
7、重(zhong)復步驟5,將血(xue)小板顆(ke)粒重(zhong)懸于0.5 ml Tyrode緩沖液中,加入0.02 U/mL腺苷三磷酸雙(shuang)磷酶,并在(zai)37℃下(xia)孵育30分鐘。
血小板表面糖蛋白的(de)單(dan)色分(fen)析(xi):
1、將5 µL特異性或陰性對照抗(kang)體和(he)25 µL稀釋的(de)全血在分析管中混(hun)合,渦(wo)旋混(hun)勻(yun)1-2秒(miao)。
2、在室溫下孵育15分鐘(zhong)。
3、加入400 µL PBS停(ting)止反應,并在30分(fen)鐘內進行分(fen)析。
如(ru)所述,將樣品與FITC綴合的對照IgG(黑線)、GPVI抗體(ti)或GPV抗體孵(fu)育。血小板(ban)通過前向散射(FSC)/側(ce)散(san)射(SSC)血小板通過前向(FSC)/側向(SSC)散射特征進行篩選(xuan)。在單獨的直方圖中(zhong)顯示了被篩選(xuan)(R1)的血小(xiao)板(ban)的熒光(guang)(FL1)強度。RBC:紅細胞。
血(xue)小板(ban)活化(hua)的(de)雙色分(fen)析:
1、將5 µL特異性或陰性對照(zhao)抗(kang)體與5 µL泛血小板(ban)標記物一起加(jia)入測(ce)定(ding)管中。
2、此時,加入小體積(ji)(<5 µL)的任何額外的試劑(如抑制劑)。
3、加入26 µL稀(xi)釋(shi)的(de)全(quan)血或經洗滌(di)過的(de)血小板(100萬),渦旋(xuan)混勻1-2秒。
在(zai)室溫(wen)下孵育15分鐘(zhong)。加入400 µL PBS停止反應(ying),并在30分鐘內進行分析。
小鼠(shu)血小板分別與(yu)PBS或0.1U/mL的(de)凝血酶(thrombin)一(yi)起與FITC和PE結合(he)的(de)mAbs一(yi)起孵育。通過GPIX或GPIIbIIIa(FL1; gate 1)的(de)表達對血小板進行(xing)了(le)篩選。
二、免疫組織(zhi)化(hua)學(用(yong)丙酮固定冷凍切片(pian))
請注意:不建議在(對)甲醛固定(ding)的樣本上(shang)進行(xing)免疫組織化學染色,因為大多數大鼠(shu)抗體在這些條件下(xia)對(dui)小鼠(shu)組(zu)織的(de)效果很差。
1、將(jiang)冷凍組織(zhi)的切片(pian)(pian)放在(zai)玻片(pian)(pian)上,并在(zai)4°C下(xia)的冰冷100%丙酮(tong)中固定20分(fen)鐘。在(zai)室溫下干(gan)燥一整夜(ye)。
2、為(wei)了(le)減少試劑(ji)的(de)用(yong)量,在(zai)玻片(pian)上的(de)組織切片(pian)周圍(wei)可以用(yong)防水筆(bi)畫一個疏(shu)水圈(quan)。在(zai)所有后續的(de)步驟中(zhong),這個圈(quan)起來的(de)區域都不(bu)應該干燥。因(yin)此,建議在(zai)潮濕的(de)盒子中(zhong)進行孵育步驟。
3、在PBS中孵育玻片20分(fen)鐘。
4、使用過氧化物酶結合的二抗時,將(jiang)玻片在室溫下與0.03%的H2O2孵育10分鐘以(yi)抑制(zhi)內(nei)源過氧化物酶活性。在PBS中三(san)次(ci)洗滌(di)玻片,每次(ci)5分鐘。
5、用PBS稀釋(比例(li)1:10或1:100)的(de)封閉液(二抗(kang)體宿(su)主物(wu)種的血清),室溫下孵育(yu)玻片(pian)1小時。
6、一抗(2-10 µg/ml)室溫(wen)孵育2小時。
7、吸取多余液(ye)體,然后在PBS中洗滌三次,每次5分鐘。
8、用熒光(guang)素或過氧化物酶(mei)結合的二抗(例如:親和(he)純化的驢(lv)抗大鼠(shu)IgG-FITC或HRP)覆蓋玻片,按照說明書(shu)在(zai)封閉液中稀釋,室溫下孵育1小時。
9、吸取(qu)多余液體(ti),PBS洗滌(di)三(san)次,每次5分鐘。
10、熒光染色的(de)樣本可以直接通(tong)過熒光顯微(wei)鏡分析(xi)。
11、為(wei)了可視(shi)化過氧化物酶標(biao)記的(de)組織,用新鮮制備的3-氨(an)基(ji)-9-乙基咔唑(AEC)底(di)物覆蓋玻片,并在顯微鏡下可(ke)見紅色染(ran)色,時(shi)間可(ke)在5至30分鐘(zhong)之間變化。在橙色背景染色出現之前,用(yong)去離子水沖洗停止反應(ying)。用(yong)伊紅染色(se)30-240秒,然后在溫水中(zhong)沖洗玻片20分鐘。使用水溶性封裝溶液固(gu)定(ding)切片。
三、免疫沉淀
緩沖液(ye)和試劑準備(bei):
PBS/EDTA:137mM NaCl、2.7mM KCl、1.5mM KH2PO4、8.0mM Na2HPO4 x 2H2O,pH 7.3;5 mM EDTA。
IP緩沖液:40 mM Tris/HCl、0.3 M NaCl、1 mM EDTA、2 mM PMSF、10µg/mL Leupeptin蛋(dan)白(bai)酶抑制(zhi)劑、10µg/mL Aprotinin抑肽酶、1µg/mL Pepstatin胃蛋(dan)白酶(mei)抑制(zhi)劑。
Igepal非離子表面活性劑:10%的H2O溶液(ye)。
2x SDS樣品緩(huan)沖液:10%β-巰基(ji)乙醇(用于還原緩沖液)、10%Tris緩(huan)沖(chong)液(ye)(1.25 M)、20%甘油、4%SDS、0.02%溴酚藍。
1、將小(xiao)鼠(shu)血(xue)小(xiao)板(ban)或細(xi)胞在(zai)1 mL PBS/EDTA(5分鐘,1300 x g)中(zhong)洗滌3次,并(bing)使用(yong)IP緩沖液重懸(xuan)。
2、加(jia)入(ru)1%Igepal 在室溫下溶解(jie)血小板(15–20分鐘)。
3、10000 x g下離心5分鐘去除細(xi)胞碎片,并(bing)將上(shang)清液(ye)轉移到新的(de)試管中(zhong)。
4、加入20µL洗滌(di)過的protein G agarose(PGA)。在4°C下混勻孵育(yu)至少3小時。
5、3000 x g離心樣品5分鐘。將(jiang)上清液轉移到新(xin)的試(shi)管中,以說明書中給定的濃度(通常(chang)在2-5µg/mL之間)加入抗(kang)體(ti),30分鐘后加入25µL洗滌過的PGA。在4°C下混勻孵育至少2小(xiao)時,最好過夜。
6、將樣品在3000 x g下離(li)心1分鐘,向PGA中加(jia)入1 mL含有1%Igepal的1 x IP緩沖液(ye)。在3000 x g下離心1分鐘。
7、用IP緩沖液中洗滌(di)PGA兩次(3000 x g離心1分(fen)鐘)。
8、加(jia)入25µL 1x SDS樣品緩沖液(還原(yuan)或(huo)非(fei)還原(yuan)),將(jiang)PGA重(zhong)懸,煮沸(fei)5分鐘。9、然后(hou)將(jiang)樣品冷凍(-20°C)以備日后使用(yong),或者(zhe)進行SDS-PAGE和(he)免疫印(yin)跡分析。
四、免疫(yi)印(yin)跡分析(Western Blot Analysis)
緩沖液(ye)和試劑準備:
裂解緩(huan)沖液:40mM Tris/HCl、0.3M NaCl、1mM EDTA、0.05%NaN3、1%Igepal。
PBS:137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1.5 mM KH2PO4、8.0 mM Na2HPO4 x 2H2O,pH 7.3。
5%脫(tuo)脂牛奶(nai)-PBS:含5%脫脂奶粉的PBS。
PBS/T:PBS含0.1%吐溫20。
1%脫脂(zhi)牛奶-PBS/T:含1%脫脂(zhi)牛奶的PBS/T。
所有步驟(zou)都(dou)可在室溫(wen)下(xia)進行:
1、在裂解(jie)緩沖液中制備小鼠血小板或細(xi)胞的裂解(jie)物,并與(2x)SDS樣品緩沖(chong)液在95°C下孵(fu)育5分(fen)鐘。
2、根據說明書,在(zai)還原或非還原條(tiao)件(jian)下,通(tong)過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(yong)(SDS-PAGE)分(fen)離(li)蛋(dan)白質,并將蛋(dan)白質轉(zhuan)移到PVDF膜上。
3、用5%脫脂牛奶封閉(bi)膜(mo)1小時。
4、加入PBS/T-1%牛奶稀釋的一抗(2-5µg/mL),孵育(yu)1小時。
5、用PBS/T沖洗膜兩次,30分鐘。洗滌程序可以減(jian)少(shao)到三次(ci),每(mei)次(ci)10分(fen)鐘。
6、加入PBS/T-1%牛(niu)奶稀釋(shi)的二抗(HRP偶聯的抗大鼠Ig),孵育45-60分鐘。
7、用PBS/T沖洗膜兩次,30分鐘。
8、使用(yong)ECL(化學發光)顯色(se)。
Emfret熱賣(mai)產(chan)品
貨號 | 產品名(ming)稱 | 規格 | 品牌 |
R300 | Antibodies for Mouse Platelet Depletion(現貨(huo)) | 0.5 mg | emfret |
M023-2 | Integrin alphaIIbbeta3 (GPIIb/IIIa, CD41/CD61)(現貨) | 1.5mL | emfret |
X488 | anti - GPIbbeta derivative Rat IgG DyLight 488 in vivo platelet labeling | 100μg | emfret |
C301 | Sterile non-immune rat IgG(現貨) | 0.5 mg | emfret |
M040-1 | GPIbalpha (CD42b)(現貨) | 1.5 mL | emfret |
D200 | JON/A Rat IgG2b PE flow cytometry 1 mL | 200 tests | emfret |
X649 | In Vivo Mouse Platelet LabelingClone:anti - GPIbbeta derivative Isotype:Rat IgG 標記:DyLight 649 Appli(現貨(huo)) | 0.1mg | emfret |
M040-2 | Xia.G5 Rat IgG2b PE FC(現貨(huo)) | 1.5 mL | emfret |
M011-1 | JAQ1/ Rat (Wistar) IgG2a FITC FC(現貨) | 1.5 mL | emfret |
M130-1 | CD62P (P-selectin) | 1.5 mL | emfret |
M040-3 | GPIbalpha (CD42b)(現貨(huo)) | 1.5 mL | emfret |
M043-0 | GPIbalpha (CD42b) Xia.B2 Rat IgG2a purif. (現貨) | 0.5 mg | emfret |
M050-1 | GPIbbeta (CD42c)Xia.C3 Rat IgG2a FITC(現(xian)貨) | 1.5 mL | emfret |
M025-1 | Integrin alphaIIbbeta3 (GPIIb/IIIa, CD41/CD61) Leo.F2 Rat IgG2aFITC | 1.5mL | emfret |
M042-0 | Xia G7 Rat IgG1 purif(現(xian)貨) | 0.5 mg | emfret |
M051-1 | GPIX (CD42a) Xia.B4 Rat IgG1 | 1.5 mL | emfret |
M011-0 | GPVI JAQ1 Rat IgG2a purif(現貨) | 0.1 mg | emfret |
M021-1 | Integrin alphaIIbbeta3 (GPIIb/IIIa, CD41/CD61) Leo.H4 Rat IgG2b | 1.5 mL | emfret |
M130-2 | CD62P (P-selectin) Wug.E9 Rat IgG | 1.5 mL | emfret |
M050-0 | GPIbbeta (CD42c) mouse and humanClone:Xia.C3 Isotype:Rat IgG2a 標記(ji):purif. | 0.5mg | emfret |
M043-1 | GPIbalpha (CD42b) Xia.B2 Rat IgG2a(現貨) | 1.5 mL | emfret |
M070-1 | Integrin alpha2 chain (CD49b, GPIa) Sam.G4 FITC | 1.5mL | emfret |
M071-1 | Integrin alpha2 chain (CD49b, GPIa) Sam.C1 FITC | 1.5mL | emfret |
M120-0 | CD31 (PECAM-1) Pec.H3 purif. | 0.5mg | emfret |
M051-0 | Purified Rat Anti-Mouse GPIX (CD42a) | 0.5 mg/mL | emfret |
P140-1 | fibrinogen polyclonal Rabbit IgGFITC FC | 1.5 mL | emfret |
P150-1 | von Willebrand Factor (vWF) | 1.5mL | emfret |
P190-2 | negative control polyclonal Rat IgGPE FC | 1.0 mL | emfret |
M030-0 | Integrin beta3 chain (GPIIIa, CD61) Luc.A5 Rat IgG2apurif. | 0.5 mg | emfret |
M025-2 | Integrin alphaIIbbeta3 (GPIIb/IIIa, CD41/CD61) | 1.5mL | emfret |
M025-3 | Integrin alphaIIbbeta3 (GPIIb/IIIa, CD41/CD61) | 1.5mL | emfret |
15210359867
400-004-3669